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    ELISA試劑盒有哪些操作應(yīng)用領(lǐng)域

    發(fā)布時(shí)間: 2017-10-30  點(diǎn)擊次數(shù): 1247次

    ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查,而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此,也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù),現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定,根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果,本法不僅可以用來(lái)測(cè)定抗體,而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原,所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大,可概括四個(gè)方面:
    1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。
    2、研究抗酶抗體的合成。
    3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。
    4、定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份。
    操作流程如下:
    (1)待測(cè)樣品孔中每孔加入待測(cè)樣品100μl,每種樣品設(shè)3個(gè)平行孔;設(shè)兩個(gè)陰性對(duì)照孔,每孔加未處理組的細(xì)胞裂解液100μl;另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔,加入純細(xì)胞裂解液100μl。 (2)酶標(biāo)板置4℃,包被。
    (3)洗板:吸干孔內(nèi)反應(yīng)液,用洗滌液過(guò)洗一遍(將洗滌液注滿板孔后,即甩去),之后將洗滌液注滿板孔,浸泡1-2分鐘,間歇搖動(dòng)。甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干。重復(fù)洗滌3-4次。
    (4)陰性對(duì)照孔每孔加入PBS 50μl,樣品孔及空白孔每孔加入1:500稀釋的兔抗人AIF抗體工作液50μl。
    (5)酶標(biāo)板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。
    (6)洗板,同(4)。
    (7)每孔加1:5000稀釋的HRP-標(biāo)記的山羊抗兔抗體工作液 100μl。
    (8)酶標(biāo)板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。
    (9)洗板,同(4)。
    (10)每孔加TMB顯色液 100μl,輕輕混勻10s,置37℃暗處反應(yīng)15-20min。
    (11)每孔加100μl 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。
    (12)分別測(cè)450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2,zui終測(cè)得的OD值為兩者之差(W1-W2),以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。
    (13)數(shù)據(jù)處理:在得出標(biāo)本(S)和陰性對(duì)照(N)的 OD值后,計(jì)算S/N值。S/N≥2.1為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。
    注:所用溶液配方
    (1) PBS:稱取0.2g KH2P04, 2.9g Na2HP04?12H20、8.0g NaCl, 0.2g KCl,加雙蒸水至1000ml。
    (2)包被緩沖液:稱取1.59g Na2CO3, 2.938 NaHCO3,加雙蒸水至 1000m1。
    (3)洗滌液(PBST):含0.05% Tween-20的PBS。
    (4)稀釋液:含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS,主要用以稀釋抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品。
    (5)TMB顯色液:稱取1.84g Na2HP04.12H20, 0.51 g檸檬酸,加雙蒸水至1O0ml,配成檸檬酸-磷酸緩沖溶液。用10.5 ml 檸檬酸-磷酸緩沖溶液溶解1錠TMB,再加入35μl 3% H2O2
    (6)細(xì)胞裂解液:1% TritonX-100,137mmol/L NaCl,20mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,1mmol/L PMSF,pH 7.4。(其中PMSF溶于異丙醇中,配成1O mmo/L,-20℃ 貯存?zhèn)溆谩?/p>

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